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            外泌體收集與寄送要求

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            注意事項:

            ● 采集的樣本需要符合納入標準:如年齡、肥胖(身高、體重)、血糖血脂血壓、診斷情況 等。

            ● 統一早晨空腹采血,盡量避免樣本間的差異影響。

            ● 如個別樣本發生溶血,則棄掉。

            ● 樣本編號用油性筆清楚地寫在管壁及管蓋上。

            ● 離心管在放入冰箱前,用封口膜密封。 

            ● 如果提供的是凍存細胞株,需提供詳盡的復蘇方法。 

            ● 細胞培養基必須使用去除 exosome(de-exosome)的血清或者無血清培養基(例如 Thermo Fisher 的 SFM)。 

            ● 分離外泌體前的樣品不能加入任何 RNA 保護劑(如 Trizol)。

            ● 分離好的外泌體如需進行電鏡觀察,需要放 4°C 保存,并且不宜保存太久。 

            ● 全血建議使用 PAXgene 管保存,不可凍融,取血后盡早制備血漿或血清,血漿或血清可 以-80°C 保存,但應避免反復凍融。

            ● 儲存條件以及儲存時間影響外泌體得率,保存在-80℃冰箱中的樣本,如果儲存時間過長, 外泌體產量也會顯著降低。 

            ● 干冰運輸應采用壁厚且質量完好的泡沫箱,24 小時到達的,干冰數量不得低于 5 公斤; 48 小時到達的,干冰數量不得低于 8 公斤;夏季適當增加干冰(1.5 倍)。


            常見實驗問題: 

            1.血漿(plasma)還是血清(serum)?

                   對于大多數涉及到 Exosome RNA 分離的研究,我們推薦使用血漿(plasma)。因為血清收集 后在凝血過程中,血小板受到刺激會產生許多 Exosome 和其他形式的小泡,因此血清中獲得 的小泡始終比血漿中多,甚至超過 50%的小泡來源于血小板。所以血漿是研究病理生理狀態 下 Exosome 更好的介質。多數的 criculating Exosome 研究樣本使用的是血漿。負壓采血之 后,血液首先存放入采血管,去除止血帶,最初的幾毫升不要,因為有壓力激活效應,并且 被成纖維細胞污染。血液收集應該輕柔并且迅速。顛倒混勻采血管 8-10 次,與管壁上的抗 凝劑混合,但不要為了抗凝而劇烈搖動。離心前管子應該垂直存放,并記錄實驗室中存放的 時間,因為從采血到離心除去細胞和血小板這中間的過程很重要,建議在 30min 內完成,長 時間的存放,而沒有及時處理會導致血小板細胞 Exosome 的進一步釋放。血液要盡快處理, 在室溫條件下分離血漿(或者血清)。所有樣品要使用相同的轉速和轉子類型離心。 

            2.怎樣選擇抗凝劑(anticoagulant)? 

                     抗凝劑有一個或多個形式的功能,包括螯合鈣、蛋白酶抑制和抑制血小板活化。有許多抗凝 血劑可用,但不建議使用肝素(heparin)抗凝劑。無論是外源性或內源性起源(例如肥大 細胞),肝素會抑制下游 PCR 反應,因為肝素會與引物和酶競爭與核酸結合。另外,肝素可抑 制 Exosome 與靶細胞的結合,抑制 Exosome 激活血小板或降低血小板激活閾值。應用肝素治 療的病人也應該注意。 對于珍貴樣本,可能需要從肝素化的血液樣品中提取 RNA。核酸的 檢測需要通過調整 PCR 的敏感性。另外如果 Exosome 相關核酸被發現只存在于 Exosome 內, 在 RNA 分離之前的洗滌也可以幫助去除肝素。其它抗凝劑如 EDTA、氟化鈉/草酸鉀(NaF/KOx), 或檸檬酸三鈉[加入/不加右旋糖 dextrose(ACD)或茶堿(theophylline)、腺苷(adenosine) 和雙嘧達莫(CTAD)]就更復雜了,最好根據下游的實驗來指導。CTAD 阻礙血小板活化和隨后 的 Exosome 釋放。EDTA 可干擾 PCR 反應(盡管程度低于肝素),但它的存在可能是無害的。另 外,下游實驗的選擇需要考慮到抗凝劑的使用種類。不同的聚合酶對抑制劑有不同的敏感性。 

            3.靜脈取血過程應該注意什么? 

                   在血液處理過程中,由于物理作用力,血小板中的 Exosome 容易在處理過程中釋放,這些外 力包括:接觸、壓力、剪切力,所以標準化的樣品處理,需要統一的注射器型號以及其他操 作。使用 21 號針頭或者更大號的針頭可以避免靜脈取血剪切力引起的不良效應。負壓采血 之后,血液首先存放入采血管,去除止血帶,最初的幾毫升不要,因為有壓力激活效應,并 且被成纖維細胞污染。血液收集應該輕柔并且迅速顛倒混勻采血管 8-10 次,與管壁上的抗 凝劑混合,但不要為了抗凝而劇烈搖動。

             4.樣本受晝夜節律,采血時間和飲食狀態的影響嗎? 

                   血液學參數在人體的一天之中是有變化的,血液粘稠度的輕微變化在幾十年前就已發現。最 近發現,晝夜節律對于血小板的激活具有很大的影響,而且比壓力(包括鍛煉身體)的影響 還要大。 白細胞穿梭以及在促炎癥因子和抗炎癥因子在血液循環中存在也在一天當中有變 化。因此,對于 Exosome 的研究,在實驗設計上,需要有嚴格的對照,采血時間在晝夜節律 上的一致才能更容易的比較樣本差異。此外,還需要考慮,樣本來源人體在正常睡眠/蘇醒 周期上的差異性。食物對于 Exosome 的影響目前還不知道,但是因為脂蛋白載著 RNA,食物 的吸收影響血液循環中脂蛋白顆粒的類型、數量和功能,因此采血可以在飯后一個統一的時 間點進行,進食記錄也是很有價值的。

             5.還需要額外的數據收集嗎? 

                   來自血液其他數據對于分析病理生理作用也是很有意義的,有時可能還需要分離其它細胞如 白細胞或者血清游離 DNA/RNA 作為 Exosome 的對照,有時需要流式細胞術配合抗體對細胞分 選或分析,確定血液細胞組分的比例。血中 Exosome 可能來自其他組織器官,有時需要從同 一個患者身上得到多種體液與血液進行對比,例如腦脊液(CSF)和血漿樣本。 

            6.溶血是否影響結果?

                    一般溶血樣本通過顏色就可以看出來,如果必要可通過分光光度計和血紅蛋白釋放實驗測量。 當分析總 exRNA,溶血的血液制品含有高濃度的特定 RNA,其中包括 miR-16 和 miR-451 等, 還有待確定 RNA 以這種方式釋放是否會干擾 exRNA 分析結果。 

            7.血液樣本需要記錄哪些信息? 

                   國際細胞外囊泡學會(International Society for Extracellular Vesicles, ISEV)推薦記 錄如下信息: 

                  采血時間 

                  采血針的類型/其他配件 

                  抗凝管的類型 

                  起始棄去的血液有多少?

                  止血帶是否移除迅速? 

                  采血時間和離心時間間隔有多久? 

                  處理注意事項(樣本是否保持垂直?是否室溫存放?) 

                  是否溶血和檢測方法? 

                  樣本處理細節(轉子類型、離心力、離心時間) 樣本分裝細節和存放 細胞是否分離? 

                  全血計數? 

                  流式檢測? 

                  是否還進行其他血液檢測? 

                  是否有匹配的其他樣本收集(比如血漿和血清,尿液,鼻液,口水等)

                  是否有病人親屬樣本作為對照 

            常見樣本問題:

            1、分離方法適用于哪些種類樣品中的外泌體提? 

                 可用于細胞上清液、血清、血漿、尿液及其他低密度體液(如腦脊液、腹水、羊水、乳汁、 唾液等)的外泌體提取。 

            2、樣品在提取外泌體之前是否可以低溫保存? 

                  可以。血樣、尿樣、體液等,需要攢齊了一起提取,或者同一個患者的樣本多次提取。凍存 前,首先要離心去除細胞和血小板,再將樣品分裝凍存于-20 或-80℃。但如果有條件最好 還是用新鮮樣品立即進行提取。長期請保存于-80℃,無須加凍存液;短期(1-2 天內)則 保存于 4℃即可。

            3、外泌體提取后是否可以凍存? 

                  可以。使用硅化 E.P.管或凍存管,減少 exosome 的粘附。Exosome 能夠承受反復凍融,建議 分裝,避免多次反復凍融。對于一些功能性實驗,建議不要凍存,直接使用新鮮提取或保存 在 4℃懸浮于 PBS 中的 exosome。4℃保存不超過一周,-80℃條件下可長期保存。 

            4、需要從血漿中分離外泌體,可以使用肝素或 EDTA 管去收集血液樣本嗎? 

                   不可以。肝素將會大大損害接下來的 RNA 實驗。EDTA 也許會干擾 PCR 實驗。使用無肝素無 EDTA 管去收集血液樣本。立即離心樣品收集血漿用于 exosome 分離。如果必須使用抗凝劑, 用 EDTA 管收集血液。如果有必要的話在接下來的 PCR 反應中調整 Mg++的濃度。采血管的選 擇:血漿(plasma):紫蓋采血管;血清(serum):黃蓋采血管(促凝管或促凝管帶分離膠)。

             5、粘度過大的樣品如何處理? 

                   如果樣品粘度過大時(因細胞分泌物較多所致),可將樣品用 1×PBS 緩沖液進行等體積稀釋。 

            6、培養細胞時,如何去除血清來源的外泌體?

                  多數情況下,細胞在體外培時養需要血清,而血清中一般都含有外泌體,為避免血清對細胞 外泌體的污染,可采用以下兩種方法: (1)將細胞培養用的血清通過 1×105g 超速離心 10h 以去除血清外泌體; (2)選擇無血清培養基進行細胞培養。

             7、無外泌體血清培養基(或者無血清培養基)在什么時候使用?

                   細胞在正常含血清的培養基中培養一定的時間后,細胞融合度約為 60%-70%時,移去原有含 血清的培養基,換成新鮮的無外泌體血清培養基(或者無血清培養基),繼續培養 24-48h, 細胞融合度達到 80%-95%左右時收取上清,該上清液即可用于提取外泌體。 

            8、細胞培養過程中的死細胞是否會影響外泌體的提?

                 會的。在收獲細胞時,應確定死亡細胞占比不超過 5%。細胞凋亡/死亡過程中會釋放大量大 小不等的囊泡,它們在外泌體的提取純化過程中會污染活細胞產生的外泌體。

            9、如何鑒定提取的外泌體?

                   通常使用透射電鏡檢測(形態)、粒徑檢測(大。、Western blot 檢測等方法鑒定提取的 外泌體。在進行 Western blot 檢測時,通常檢測外泌體標志蛋白(CD63、CD9、CD81、TSG101 等),按照國際細胞外囊泡協會的建議為檢測 2 個陽性和 1 個陰性指標。

            10、準備做細胞外泌體 Small RNA 的 NGS 測序,初始樣品量需要準備多少?

                   普通腫瘤細胞系推薦使用 40mL 以上的初始樣品量。由于某些細胞(如懸浮細胞、干細胞、 神經細胞等)中外泌體含量比較低,建議先通過 10kD 超濾柱濃縮,準備 40mL 以上的濃縮液 再進行超速離心分離外泌體,一般需提取到 20ng 以上的 Total RNA。

            11、進行外泌體 RNA RT-PCR 實驗推薦什么內參?

                   取決于具體樣品,可以選擇外源添加 cel-miR-39-3p,或內源 U6、SNORD61、SNORD68、SNORD72 作為內參。

            12、提取的外泌體進行 Western blot 前是否需要加入 RIPA 試劑裂解? 

                   需要,一般按照 1:1 的比例加入 RIPA 試劑。 

            13、進行外泌體 Western blot 鑒定時有無內參蛋白可供選擇? 

                    無,該檢測屬于定性檢測。

            14、組織細胞外泌體如何提? 

            無菌環境下將組織剪成小塊(越小越好),然后在無血清的培養基中培養 12h;將培養液轉 移至離心管中,于 4℃以 3000g 離心 20 min 去除培養液中雜質和細胞碎片,將上清液轉移 至新的離心管中;先使用 0.45μm 濾器過濾上清液,接著使用 0.2μm 濾器過濾上清液,再 進行超速離心分離外泌體。有條件的話建議采用 Transwell 小室培養的方式,效果更佳。


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