外泌體NTA結果怎么看？外泌體檢測

　　外泌體NTA結果怎么看？外泌體參與神經疾病和癌癥等很多種疾病的病理過程，同時在正常的生理過程中也發揮著介導細胞間通訊的重要功能。細胞外囊泡在臨床醫學中也有十分光明的應用前景，由于它們含有豐富的生物標志物，可用于監測疾病進展，治療反應等，同時由于外泌體具有攜帶遞送生物分子的功能，具有成為臨床藥物遞送載體的潛力。外泌體的功能研究一步，即進行外泌體的鑒定。

　　外泌體是由細胞分泌的直徑在30~150nm的膜性小囊泡，那么是否存在直徑大于150nm或與外泌體大小相近的其它膜性小囊泡呢？答案是肯定的。這里就要說到細胞外囊泡（EVs），EVs是由細胞釋放的膜性小囊泡，直徑在30nm到9μm之間，根據直徑的大小，可細分為三大類：外泌體（30~150nm）、微囊泡（100-1000nm）和凋亡小體（50-2000nm）。

　　國際細胞外囊泡學會（ISEV）在2014年提議，對于分離獲得的外泌體需要從三個層面進行鑒定：（1）Western Blot（WB）鑒定外泌體表面標志物；（2）透射電鏡（TEM）鑒定外泌體形態；（3）粒徑分析（NTA）鑒定外泌體大小。

　　01.WB驗證：檢測外泌體標志蛋白的表達情況

　　鑒定外泌體首先需要通過WB來鑒定外泌體的標志蛋白是否存在于樣品中，外泌體形成于早期胞內體，在內吞體轉運復合體（ESCRT）及一些相關蛋白的調控下，早期胞內體發生內出芽形成多個腔內小囊泡，構成多胞體（MVB），MVB最后在GTPase家族中的RAB酶調解下與細胞膜融合向外界釋放囊泡。

　　外泌體膜上富含參與外泌體運輸的四跨膜蛋白家族（CD63、CD81和CD9)）、熱休克蛋白家族（(HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2和HSP90)以及一些細胞特異性的蛋白包括A33（結腸上皮細胞來源）、MHC-II(抗原提呈細胞來源)、CD86(抗原提呈細胞來源)以及乳凝集素（不成熟的樹突狀細胞）。其中CD63、CD9、CD81以及TSG101、HSP70、ALIX等，是最常用到的細胞外囊泡標志物。

　　這些標志物蛋白其實主要是涉及到了囊泡的形成和分泌過程，他們產生于細胞中，定位于胞內的膜結構附近，如四旋蛋白（CD9，CD63和CD81），直接參與了細胞外囊泡內容物的分選；TSG101是ESCRT復合體相關的蛋白，而ESCRT復合體是膜形成和斷裂的驅動器。ALIX直接涉及到了膜泡在形成過程中切割脫離質膜形成獨立膜結構的過程。

　　02電鏡：分析外泌體的大小/形態等

　　掃描電鏡(scanning electron microscopy,SEM)或透射電鏡(transmission electron microscopy,TEM)等電子顯微鏡可用于外泌體鑒定。SEM的工作原理是用能量為1~30 KV間的電子束，以光柵狀掃描方式照射到被分析試樣的表面上，利用入射電子和試樣表面物質相互作用所產生的二次電子和背散射電子成像，獲得試樣表面微觀組織結構和形貌的高分辨率信息。由于超高真空技術的發展，場發射電子槍的應用得到普及，現代先進的SEM的分辨率已經達到1 nm左右，足夠用來進行外泌體尺寸的測量。TEM是把經加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產生立體角散射。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關，因此可以形成明暗不同的影像，影像放大、聚焦后在成像器件(如熒光屏、膠片、感光耦合組件)上顯示出來。

　　操作步驟大致是：

　　用PBS重懸提取的外泌體，滴于孔徑2 nm的載樣銅網上，室溫靜置2 min，用濾紙從濾網側邊吸干液體，用3%磷鎢酸溶液在室溫下負染5 min，濾紙吸干負染液，室溫晾干，電鏡觀察拍照。外泌體在電鏡下具有非常明顯的膜邊界、呈30~100 nm大小不一的茶托或杯狀結構(也會有200 nm以下、較難鑒別的其他形狀的外泌體)，但電鏡對樣品的預處理和制備要求較高，樣品分離方法和樣品性質可能影響電鏡結果的好壞；樣品的準備階段比較復雜，不適合對外泌體進行大量快速的測量；且因外泌體經過了預處理和制備過程，無法準確測量。

　　以上兩種方法是最常用的外泌體的鑒定方法，是展開外泌體功能研究的前提。比如在腫瘤研究中，通過提取鑒定不同細胞系中的外泌體，進而通過PCR以及測序篩選分析RNA，探究外泌體在腫瘤進展或者耐藥中的發生機制。

　　外泌體像一把“雙刃劍”，與癌癥進展有著密切的聯系，參與促進癌細胞的增殖與擴散，對癌癥的發生及惡化有著重要的作用。但外泌體又可以應用于癌癥的診斷與治療，目前外泌體在癌癥診斷與治療中的應用尚處于初級階段，未來仍需要對外泌體的作用進行更深入地探究，使其更好地應用于臨床。

　　03納米顆粒示蹤分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)檢測外泌體粒徑及濃度

　　在外泌體研究領域，NTA技術已被用作外泌體表征手段之一；相較于其他表征方式，NTA技術的樣本處理更簡單，更能保證外泌體原始狀態，檢測速度更快。大致方法是：將收集的外泌體用PBS稀釋至106/mL，用1 mL注射器注入納米顆粒跟蹤分析儀(如裝有450 nm激光器的Nanosight NS300顆粒粒度分析儀)；激光光束穿過樣本室外泌體顆粒，通過裝有攝像頭的顯微鏡實現顆�？梢暬�，捕捉外泌體的布朗運動，利用愛因斯坦方程式根據其運動計算濃度和流體力學直徑。SBI公司新開發的一種排除非外泌體顆粒干擾的試劑盒，還可幫助實現對完整外泌體的NTA分析。

　　04.流式細胞儀檢測外泌體的生物標志物

　　流式細胞儀檢測技術比較快速，適合高通量篩選，且可分析顆粒的大小與體積。用外泌體表面特異性標志物相應的抗體進行標記，用流式細胞儀檢測其陽性表達，從而驗證外泌體。如染色后的外泌體溶液加入分支聚乙烯亞胺(PEI)，37oC孵育15 min，之后超速離心去除PEI，然后加入金納米顆粒，輕柔重懸后置于培養箱中60 min，加入別藻藍蛋白(allophycocyanin,APC)DNA染料，室溫孵育15 min后流式細胞儀檢測。APC陽性的顆粒即為所需檢測的外泌體。